Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недо­статков и ошибок, т
Учебные материалы


Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недо­статков и ошибок, т



Карта сайтаПереход по ссылке Переход по ссылке Переход по ссылке Переход по ссылке

Загрузка...
Загрузка...
Загрузка...

^ Использование ферментов


в аналитической практике


Ферментативный анализ представляет собой один из основных ана­литических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертифика­ционного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и био­логических материалов.
Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов. Cлова одного из основоположников ферментативного анализа Г. Бергмана отражают достоинства обсуждаемых методов: «Ферментативный анализ, как принцип, свободен от недо­статков и ошибок, т.к. он представляет систему для измерений, которую успешно использует живая клетка уже в течение миллионов лет».
В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводят in vitro реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализи­руемое вещество пробы. Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, иденти­фикации и установления фальсификации сырья и продуктов питания являются четыре принципа.
1. ^ Высокая специфичность и достоверность ре­зультатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарности пространственной конфигурации активного цен­тра и субстрата является гарантом достоверности и надежности фермен­тативного метода при исследовании отдельных соединений в многоком­понентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных мето­дов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наи­большей специфичностью действия, для которых подбираются оптималь­ные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов обычно используют несколько ферментов, которые последовательно фун­кционируют в данной системе.
2. ^ Простые способы подготовки проб, которые ис­ключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, - по воз­можности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подго­товки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуе­мому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хоро­шо известные способы подготовки проб, такие как разбавление, фильт­рация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных слу­чаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крах­мал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.
3. ^ Простая и быстрая процедура измерений, кото­рая исключает использование дорогостоящего обо­рудования. В большинстве ферментативных определений исполь­зуют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плот­ности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. Через определенный промежуток времени повторно из­меряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптичес­ких плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Лам­берта-Бера рассчитывают концентрацию С, г/л, искомого соединения:
, (3.8)
где 2 - Е1)опыт - разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой;
2 - Е1) - разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы;
V - общий объем реакционной смеси, мл;
М - молярная масса искомого соединения, г/моль;
F - фактор разведения пробы;
ε - молярный коэффициент экстинкции (например, кофермента НАДФ/НАД при λ=340 нм, ε =6,3 );
d - толщина кюветы, см;
 - объем пробы, добавляемый в кювету, мл.
В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическо­му контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД+/НАДН или НАДФ+/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопропорционально количеству искомого соединения. Система конечных зна­чений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, ко­торое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и до­заторы, весы, центрифуга, рН-метр, термостат, фильтры и т.д.
4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения сле­довых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол - 0,001; ацетоальдегид - 0,001; лимонная кислота - 0,002; глицерин - 0,001; D-глюкоза - 0,002; D-сорбит - 0,001; лактоза - 0,005; нитраты - 0,001.
Области применения ферментативного анализа на практике многооб­разны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой про­дукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.

^ Использование ферментных препаратов


в технологии продуктов питания


Мукомольное производство и хлебопечение. Качество хлеба определяется особенностями химического состава муки и активностью ее ферментного комплекса. Значительное влияние оказывают также условия брожения и выпечки. Получить хлеб хорошего качества можно только в том случае, когда в процессе тестоведения гар­монически сочетаются скорости микробиологических процессов и био­химических превращений. Ферментативный гидролиз высокомолекуляр­ных компонентов сырья - белков и углеводов - в определенной степе­ни способствует интенсификации этих превращений и, в конечном сче­те, положительно сказывается на качестве хлеба.
Если раньше в качестве источника ферментов использовали солод, то в последние годы все большие масштабы приобретает применение фер­ментных препаратов для регулирования биокаталитических процессов, протекающих при приготовлении теста, и выпечки хлеба. Солод исполь­зуется в основном для приготовления питательных сред (заварок) для жид­ких дрожжей, для активации прессованных дрожжей, а также при вы­печке специальных сортов хлеба, например, «рижского».
Эффективность использования тех или иных ферментных препара­тов в хлебопечении в значительной степени зависит от качества муки. Хлебопекарные свойства муки, в особенности качество клейковины и ак­тивность собственных ферментов, определяют требования к фермент­ным препаратам.
Основным препаратом, широко используемым в хлебопекарной про­мышленности, является амилоризин П10Х. Препарат получают из повер­хностной культуры А. оrуzае осаждением этанолом. Он обладает амилолитической и протеолитической активностью. В соответствии с нормативной документацией пре­парат должен удовлетворять следующим требованиям: амилолитическая способность - 2000 ед/г препарата; осахаривающая способность - 150 ед/ г препарата; протеолитическая активность - 7 ед/г препарата. Кроме того, особо важное значение для хлебопекарной промышленности имеет сте­пень обсемененности препарата спорами Вас. mesentericus (картофельная палочка) и Вас. subtilis (сенная палочка). Существенный признак пораже­ния хлеба картофельной палочкой - тягучий мякиш и появление специ­фического неприятного запаха и вкуса, поэтому на хлебозаводах при вы­работке хлеба с использованием препарата амилоризина П10Х каждую партию препарата проверяют на обсемененность спорами Вас. mesentericus (она не должна превышать величину 105). Одним из требований, обуслав­ливающих стабильность ферментных препаратов, является их строгая стандартизация. За рубежом для этой цели используют различные наполните­ли: сахар, крахмал, декстрины и т.д. В нашей стране наряду с этими на­полнителями применяют сернокислый аммоний, именно он включен в ГОСТ на амилоризин П10Х.
Получить хлеб с надлежащей пористостью, объемом и окраской кор­ки можно только в том случае, если на всех стадиях технологического процесса достаточно сахаров, обеспечивающих интенсивность газооб­разования. Несмотря на присутствие в муке собственных сахаров, хлеб, полученный за счет сбраживания только собственных сахаров муки, не будет отвечать требованиям стандарта. При газообразовании только за счет собственных сахаров муки максимум выделения диоксида углерода приходится на первые 1-2 часа брожения. Между тем в процессе хлебо­печения газообразование в тесте должно оставаться достаточно высоким и на последней стадии (расстойка и первые 10-15 минут выпечки). При наличии в муке активной β-амилазы газообразование в процессе броже­ния теста идет по возрастающей и максимум приходится на 4 часа бро­жения. В противном случае для получения дополнительного количества сбраживаемых сахаров и интенсификации процесса брожения необхо­димо применение амилолитических ферментных препаратов.
Однако значение сахаров, безусловно, не ограничивается только про­цессом брожения. Огромную роль сахара играют в образовании крася­щих и ароматических веществ хлеба, участвуя в реакции меланоидинообразования.
Исключительно важны для хлебопечения и те изменения, которые пре­терпевает при тестоведении и расстойке белковый комплекс муки. Имен­но белковый комплекс и его ферментативные изменения определяют со­бой физические свойства теста. От белкового комплекса зависит как пове­дение теста при его замесе и расстойке (в частности, формоудержание), так и качество готового хлеба, его объем, пористость, структура мякиша.
Говоря о протеолитических ферментах, воздействующих на белковый комплекс муки, необходимо еще раз отметить эндогенные протеазы зер­на пшеницы, среди которых наибольшее значение имеют нейтральные протеазы, превосходящие по своей активности кислые протеазы в не­сколько раз и способные в условиях теста эффективно расщеплять белки клейковины.
^ Производство крахмала и крахмалопродуктов. Современная крахмало-паточная промышленность, используя в ос­новном традиционные источники сырья - картофель и кукурузу - вы­рабатывает большой ассортимент продукции, включающий десятки наи­менований, которые используются в различных отраслях промышленности. В первую очередь, это отрасли пищевой промышленности (кон­дитерская, хлебопекарная, молочная, консервная, пищеконцентратная и т.д.), а также другие отрасли (медицинская, текстильная, полиграфи­ческая и др.). Основными продуктами крахмало-паточного производства являются: сухой крахмал; модифицированные крахмалы: расщепленные крахмалы (окисленные и набухающие); замещенные крахмалы (фосфатные, ацетилированные, сополимеры крахмала); декстрины; различные виды крахмальных паток: карамельная (38-44 % редуцирующих веществ), кара­мельная низкоосахаренная (30-34 % редуцирующих веществ), глюкозная высокоосахаренная (44-60 % редуцирующих веществ), мальтозная (не менее 60 % редуцирующих веществ); глюкоза (техническая, пищевая, кристаллическая); глюкозо-фруктозные сиропы.
В натоящее время в России ведется поиск новых источников крахма­ла и разработка новых технологических приемов с целью увеличения объе­ма и расширения ассортимента вырабатываемых сахаристых крахмало-продуктов. Одним из таких перспективных видов крахмалсодержащего сы­рья является зерновое сорго, которое может быть использовано наряду с картофелем, кукурузой, рисом и пшеницей. Кроме того, ведется поиск и исследование новых амилолитических ферментных препаратов и спосо­бов ферментативного получения сахарных сиропов (гидролизатов) различ­ного углеводного состава с учетом их целевого назначения.
Ферментные препараты амилаз нашли широкое применение в технологиях получения различных паток и глюкозы. Первой технологической операцией производства крахмальных гид­ролизатов является гидролиз крахмала. Его проводят кислотным, кис­лотно-ферментативным или ферментативным способом. Во всех случа­ях процесс гидролиза включает стадии клейстеризации крахмала, раз­жижения крахмального клейстера и его осахаривания.
Кислотный гидролиз в настоящее время осуществляется, в ос­новном, с применением соляной кислоты. При этом можно достичь раз­личной степени гидролиза и получить гидролизаты с различной степенью осахаривания. Однако кислотный гидролиз крахмала, несмотря на деше­визну и быстроту процесса, имеет весьма существенные недостатки: полу­чаемые гидролизаты имеют невысокое качество из-за присутствия в них продуктов деградации белков, а также минеральных примесей, которые образуются при нейтрализации кислоты после гидролиза.
Кислотно-ферментативным методом производят раз­жижение крахмала сначала кислотой (для этого суспензию крахмала под­кисляют соляной кислотой до рН 1,8-2,5, нагревают до 140 °С в течение 5 минут), а затем нейтрализуют раствором кальцинированной соды до рН 6,0-6,5 и охлаждают до 85 °С, после чего добавляют пре­парат α-амилазы и ведут гидролиз в течение 30 минут. С целью разжижения на этой стадии используют ферментный препа­рат амилосубтилин Г10Х. Этот препарат выпускается в виде порошка; содержит в основном α-амилазу и β-глюконазу. Оптимальные условия действия препарата: рН 6,2-6,8, температура 85-87°С.
Осахаривание полученного гидролизата также проводят с использо­ванием ферментов. Для этой цели наиболее широко применяют порош­кообразный ферментный препарат глюкавомарин Г20Х. Препарат содержит в основном глюкоамилазу. Оптимальные условия действия препарата глюкоавомарина Г20Х: оптимум рН 4,0-5,5; опти­мум температуры 56-58°С.
Ферментативный способ заключается в том, что 30-35 %-ную крахмальную суспензию прогревают до 55°С, доводят рН до 6,3-6,5, до­бавляют раствор ферментного препарата амилосубтилина Г10Х и раствор кальцинированной соды в качестве стабилизатора. Процесс разжижения длится в течение 1 часа при температуре 85-90°С при непрерывном пе­ремешивании. Далее стадия декстринизации и осахаривания проводит­ся с использованием препаратов амилосубтилина Г10Х, амилоризина Г10Х и П10Х. Этот процесс идет 2-3 часа при температуре от 53 до 85°С и рН 4,7-5,5.
Дальнейшее осахаривание ведут при 60°С и оптимальном рН, а про­должительность осахаривания зависит от желаемого результата (требуе­мой степени осахаривания). Инактивацию фермента и остановку про­цесса гидролиза производят нагреванием продукта при 80°С в течение 20 минут. Ферментный препарат амилоризин П10Х и ферментный препарат амилоризин Г10Х имеют оптимальные условия действия: рН 4,8-5,3 и температуру 53-55°С.
В данном случае важно сказать о применении глюкозоизомеразы. Фермент глюкозоизомераза (К.Ф. 5.3.1.18) катализирует реакцию изомеризации глюкозы во фруктозу, т.е. превращение альдозы в кетоформу за счет внутримолекулярного процесса окисления одной части молекулы и соответствующего восстановления другой части. Фермент обнаружен в растениях и продуцируется различ­ными микроорганизмами.
На реакции ферментативной изомеризации основана технология по­лучения глюкозно-фруктозных сиропов из крахмала. Для получения глюкозно-фруктозных сиропов используют гидролизаты кукурузного крах­мала с высоким содержанием крахмала (96-98 %), полученные с помо­щью ферментативного гидролиза. Процесс изомеризации под действи­ем иммобилизованного (закрепленного на носителе) ферментного препарата глюкозоизомеразы длится в течение 20-24 часов (до содержания в гидролизате 42 % фруктозы и 52 % глюкозы). В ходе процесса необходи­мо контролировать и поддерживать оптимальные условия для работы фермента: температуру 60°С, рН 7,0-8,5. Кроме того, для повышения активности фермента и его стабильности в субстрат добавляют ионы маг­ния и кобальта (в виде растворимых солей), а также бисульфит для пре­дупреждения развития микрофлоры. Ионы кальция ингибируют фермент.
Иммобилизованные препараты глюкозоизомеразы характеризуются двумя важными показателями: период полужизни препарата, т.е. время, за которое активность фермента снижается наполовину (при оп­тимальных условиях проведения процесса), и продуктивность, т.е. количество килограммов глюкозы (на абсолютно сухое вещество), изомеризованное 1 кг или 1 л ферментного препарата при многократном использова­нии. Для большинства препаратов период полужизни составляет 20-35 суток, про­дуктивность - до 2000 кг глюкозы на 1 кг фермента.
Полученные с помощью ферментативной изомеризации глюкозо-фруктозные сиропы обладают более высокой сладостью, по сво­им свойствам они близки к инвертному сахару, благодаря чему широко применяются в производстве продуктов детского и диетического питания, хле­бобулочных изделий, напитков, кондитерских изделий, мороженого и т.д.
^ Кондитерское производство. Кондитерские изделия в зависимости от вида сырья и типа технологи­ческого процесса подразделяют на две группы: мучные и сахарис­тые. К мучным изделиям относятся печенье, галеты, крекеры, вафли, пря­ники, кексы, пирожные, рулеты, торты; к сахаристым - какао-порошок, шоколад, конфеты, карамель, мармелад, пастила, ирис, драже, халва. Применение ферментных препаратов в кондитерском производстве обусловлено, с одной стороны, видом и свойствами сырья, с другой - технологической необходимостью и целесообразностью.
Комплексные ферментные препараты протеаз и амилаз, содержащие активные протеазы и α-амилазу (например, амилоризин П10Х), применяют при производстве мучных кондитерских изделий с целью ускорения процесса брожения и корректировки физических свойств клейковины муки, изменения реологических свойств теста, ус­корения его «созревания».
При производстве мучных кондитерских изделий с использованием дрожжей, таких, как галеты, крекеры, кексы, целесообразно применение комплексных препаратов с преобладанием протеолитического действия, но содержащих в своем составе α-амилазу. Совокупное действие этих ферментов обеспечивают дрожжи сбраживаемыми сахарами и низкомо­лекулярными азотистыми веществами. Часть не использованных при бро­жении сахаров и азотистых веществ вступает в реакцию меланоидинообразования, благодаря чему галеты и крекеры приобретают интенсивную окраску и приятный аромат.
При производстве затяжного печенья с использованием химических разрыхлителей, когда много усилий направляется на расслабление клей­ковины, на протяжении длительного технологического процесса наряду с механическим воздействием на белки клейковины целесообразно ис­пользование протеолитических ферментных препаратов; α-амилаза, при­сутствующая в качестве сопутствующего фермента как в грибных, так и бактериальных препаратах, не мешает их использованию.
В случае применения бактериальных протеолитических препаратов (например, протосубтилина Г10Х), содержащих в качестве сопутствую­щего фермента α-амилазу, при производстве изделий, подобных креке­рам, галетам, печенью опасности излишней декстринизации не существу­ет, т.к. фермент быстро инактивируется за счет того, что эти тонкие из­делия быстро прогреваются до высокой температуры. При выработке кексов, а также бисквитного полуфабриката, выпекающихся в довольно толстом слое при невысокой температуре, в случае необходимости при­менения комплексных бактериальных препаратов следует осторожно под­ходить к их дозировке во избежание порчи мякиша. Необходимо также учитывать, что усиленное механическое воздействие на кондитерское тесто приводит к повышению атакуемости ферментами полимеров муки: крахмала, белков, других веществ, усиливая тем самым эф­фект гидролиза.
Для заварных и сырцовых пряников наибольшее значение имеет протеолиз, но наряду с потребностью в регулируемом расслаблении теста важным является и сохранение свежести (мягкости) продукта. Очевид­но, что при производстве таких видов изделий целесообразно примене­ние комплексных ферментных препаратов с преобладанием протеолитической активности.
При производстве бисквитного полуфабриката нужны комплексные ферментные препараты с умеренной активностью протеолитических фер­ментов и невысокой α-амилазной (декстринирующей) способностью. При таком сочетании обеспечивается умеренное расслабление клейко­вины, способствующее лучшему подъему теста при выпечке и образова­нию тонкопористой воздушной структуры готовых изделий. Образова­ние декстринов, в свою очередь, способствует сохранению их свежести.
Комплексные ферментные препараты, содержащие протеазы и α-амилазу, используются для ускорения и облегчения обработки теста при приготовлении слоеного полуфабриката с целью улучшения его эластичных свойств и предупреждения усадки при выпечке. Кроме того, приме­нение таких ферментных препаратов при производстве вафель позволя­ет оптимально снизить вязкость вафельного теста, способствует получе­нию тонких вафельных листов.
Препараты инвертазы, как уже отмечалось, получают из дрожжей S. cerivisiae или S. carlsbergensis путем автолиза. Они представляют собой суспензию спиртоосажденной инвертазы в 25 %-ом, 50 %-ом растворе глицерина или 70 %-ом растворе сорбита. Оптимум рН действия препарата 4,5-5,5, что вполне приемлемо для его использо­вания в различных технологиях производства сахаристых изделий. Инвертаза применяется в кондитерской промышленности для про­изводства отливных помадных корпусов конфет, круглых помадных кор­пусов и жидких фруктовых начинок, таких, как вишневый ликер. В каж­дом случае ее применение обусловлено необходимостью получить полу­мягкую или жидкую консистенцию при высоких концентрациях сахара (78 %), предотвращающих брожение. Ускорение или замедление действия инвертазы достигается путем изменения концентрации вносимого пре­парата, количества воды и температурного режима. При высокой темпе­ратуре инвертаза инактивируется, и даже при температуре отливки (65°С) активность инвертазы снижается на 12 % в течение 30 минут и на 24 % в течение 60 минут. Некоторые сорта конфет, например, конфеты с виш­невым ликером, невозможно изготовить без инвертазы. В случае произ­водства помадной массы из кокосовых орехов применение инвертазы обусловлено и повышенной влагоудерживающей способностью фрукто­зы, образующейся под действием этого фермента.
Молочные ингредиенты широко применяются при производстве кондитерских изделий, они в значительной мере обус­ловливают их аромат и вкус. В усилении аромата молочного шоколада, карамели, ириса, сливочного крема наряду с дру­гими компонентами принимают участие и свободные жирные кислоты, образующиеся под действием липаз. При низких уровнях свободных жир­ных кислот аромат изделий усиливается, но новые ароматы не образуют­ся; при средних - появляется аромат масла; при высоких - аромат сыра. Подобные ароматические вещества могут быть получены путем моди­фикации масел или жиров с применением ферментных препаратов липаз различного происхождения.
^ Молочное производство. В отношении использования липаз в молочной промышленности интересны данные, опубликованные М.С. Уманским (табл. 3.3). Они показывают липолитическую активность молокосвертывающих ферментных препаратов, которую необходимо учитывать в технологии сыров.
Научно-практическое значение этих сведений велико. Один из классиков отечественного молочного дела А.И. Чеботарев справедливо указывал: «… трудно представить, чтобы при резких изменениях остальные вещества сырной массы, жир не претерпевал изменений. Скорее всего следует полагать, что изменения эти количественно невелики, но образующиеся при разложении жира вещества обладают ярко выраженными вкусовыми свойствами».
Таблица 3.3


edu 2018 год. Все права принадлежат их авторам! Главная